style="width:3.1067in" />GB/T 33682—2017 本文是学习GB-T 33682-2017 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物的方法通则。
本标准适用于各类从事微生物相关检验工作实验室对样品中的微生物进行快速鉴定以及研究，可
鉴定微生物种属。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.10—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18204.3—2013 公共场所卫生检验方法 第3部分：空气微生物
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
全微生物蛋白质指纹图谱 microbial protein
fingerprinting
未经处理的微生物菌苔(如固体培养基上的菌落),直接涂于靶板上，待干燥后加上基质混合，全细
菌可溶性蛋白与基质形成共结晶体后通过真空飞行时间管获取不同质电荷比的蛋白分子质谱指纹
图谱。
下列缩略语适用于本文件。
CHCA:a- 氰基-4羟基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinnamicacid)
DHB:2,5- 二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)
MALDI-TOF MS:基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ioni-
zation Time of Flight Mass Spectrometry)
常见微生物都由其区别于其他种类的特殊蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱，这是由物
种的遗传特性所决定的，受外界环境条件等影响较小。
样品(来自痰、血、体液、拭子等临床样本及食品、化妆品、药品及环境等)经适当的处理，在固体培养
GB/T 33682—2017
基上培养、分离出单个菌落后，直接点样至靶板并将其放入基质辅助激光电离解析飞行时间质谱
(MALDI-TOF MS)内，经离子化按照质量/电荷(m/z)
比值大小分离，将采集的数据与微生物指纹图
谱库对照鉴定。
除非有特殊说明，仅使用色谱纯试剂和符合GB/T6682 规定的一级水。
6.6 a-氰基-4羟基肉桂酸(C₀H₇NO₃), 光谱纯。
6.7 2,5-二羟基苯甲酸(C,H₆O₄), 光谱纯。
6.8 血琼脂培养基：按照GB 4789.10—2016中 A.2 的规定执行。
6.9 沙氏琼脂培养基：按照GB/T 18204.3—2013 中4.2.2.1的规定执行。
6.10 标准菌株：ATCC8739 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
7.3 恒温培养箱：36℃±1℃、25℃±1℃。
7.4 离心机：12000 r/min。
痰、血、体液、拭子等临床样本经采集后直接接种。其他固体样品需粉碎，加入无菌磷酸盐稀释液溶
解，液体样品可不经过溶解。
一般细菌划线接种血琼脂培养基，36℃±1℃培养24 h±2h;
酵母划线接种沙保弱葡萄糖琼脂培 养基，25℃±1℃培养2 d～3d;
其他类型微生物，如霉菌、分枝杆菌和诺卡氏菌等，可参照相关标准中
规定的培养基和培养方法执行。
style="width:3.1067in" />GB/T 33682—2017
鉴定细菌时，直接使用1 μL
接种环挑取单个菌落，点在样品靶板孔中，涂抹均匀并在室温自然晾
干。如果鉴定酵母，需要用微量移液器吸取0.5μL25%
FA溶液(破坏细胞壁，使蛋白溶出)。用微量
移液器吸取1μL 基质溶液，与样品混合，自然晾干，形成结晶(基质可选择
CHCA、DHB 中的一种)。
将无菌棉拭子在去离子水中沾湿后，从沙氏培养基上刮取1 cm²~2 cm²
霉菌菌落，转移至装有 300μL 超纯水的2 mL 离心管中。向离心管中加入900 μL
乙醇，用漩涡混合器混匀3 s～5 s。混合后 用离心机在10000 r/min
下离心2min 后去除上清液，置于室温干燥。加入40 μL70% 甲酸漩涡混合 3
s～5s,之后再加入40μL 乙腈漩涡混合3 s～5 s,用离心机在10000 r/min
离心2min 后，用微量移
液器吸取1 μL 样品加在样品靶板孔中，待室温干燥后再加入1 μL
基质溶液，在室温下自然晾干。
所有标本、微生物培养物以及接种后的实验材料均应在符合 GB 19489
规定的相应生物安全等级
的实验室条件下进行操作，并适当处置。
8.4.1 仪器：MALDI-TOF MS。
8.4.2 激光能量：每激光束能量100μJ, 激光能量可从0%～100%范围调节。
8.4.3 质谱扫描范围：2000 Da～20000 Da。
8.4.4 微生物指纹图谱库：VMS Plus Database'或同等类型数据库。
将标准菌株 ATCC8739 大肠埃希氏菌转种至血琼脂培养基上36℃±1℃培养24
h±2h。 每次检
测样品前推荐使用ATCC8739 大肠埃希氏菌的11个特征峰校准飞行时间质谱。
将样品靶板放入仪器内，设定合适的激光能量，质谱扫描范围等参数，开始质谱数据采集。数据采
集完成后，将经过处理的质谱数据自动/手动导入本地微生物指纹图谱库即微生物鉴定系统，并在鉴定
系统中鉴定结果。
图谱数据经指纹图谱库运算后直接显示菌株的鉴定结果，并以颜色显示每个涂菌点位的鉴定结果
的置信水平。
参照微生物质谱鉴定系统的鉴定置信水平报告微生物鉴定结果。
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